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谈谈有关NEB内切酶反应的经验和技巧
点击次数:1952 发布时间:2018-03-27
酶切反应条件的优化当建立NEB内切酶酶切反应体系时有几个关键因素需要考虑。下面整理了以下有关NEB内切酶反应的经验和技巧。
标准反应体系:
限制性内切酶10units*
DNA1μg
10XNEBuffer5μl(1X)
总反应体系50μl
温育温度因酶而异
温育时间60分钟
*足够切割所有类型的DNA。
省时酶切反应体系:
限制性内切酶1μl
DNA1μg
10XNEBuffer5μl(1X)
总反应体系50μl
温育温度因酶而异
温育时间5-10分钟*
*具有省时酶切特性的内切酶也可以过夜反应而没有星号活性。
NEB内切酶
•从冰箱取出后请一直置于冰上。
•酶zui后加入到反应体系中。
•加入酶之前将反应混合物混匀,可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁,然后在离心机中快速离心。切忌振荡混匀。
•一般情况下,我们推荐使用5-10单位酶量/μgDNA,基因组DNA用10-20单位酶量消化1小时。
•NEB推出一系列的高保真(HFTM)内切酶,为建立酶切反应体系提供了更多便利。
•如果使用RE-Mix®,请参考2013﹒2014商品目录276页的操作方法。
DNA
•避免酚、氯仿、酒精、EDTA、变性剂或过多盐离子的污染。推荐在纯化过程中多清洗几次。
•甲基化的DNA会抑制某些酶的切割效率。
缓冲液
•使用终浓度为1X的缓冲液。
•BSA已被添加到NEB缓冲液1.1、1.2、1.3和CutSmart缓冲液中,无需额外添加BSA。
•在不需要BSA即可达到zui佳活性的酶切反应中如果加入BSA也不会影响酶切效果。
反应体系
•建议在50μl反应体系中消化1μg底物DNA。
•加入内切酶的量应不超过总体积的10%,以避免甘油过量引起的星号活性。
•内切酶贮存液中的添加物(如:甘油和盐)和底物溶液中尚存的残余物(如:盐、EDTA或乙醇)会导致小体积反应出现问题。下述为小体积反应技术指南。
酶切反应体系的选择
*当内切酶用量小时,用推荐稀释液稀释后使用。
**使用10μl反应体系时,温育时间不要超过1小时,以防蒸发。
温育时间
•标准体系温育1小时,省时酶切体系温育5-15分钟。
•使用省时内切酶。
•许多内切酶都可以用更少单位的酶消化16小时。
终止反应
若消化后的DNA不需要进行后续实验操作:
•用终止液终止反应[50%甘油、50mMEDTA(pH8.0)和0.05%溴酚蓝](如NEB#B7021)。按每50μl反应体系中加入10μl的比例进行。
若消化后的DNA需要进行后续实验操作:
•用热失活法(以确定该酶能否热失活)。
•若该酶不能热失活,利用商业化的离心柱或酚/氯仿抽提去除内切酶。
贮存
•大多数内切酶建议保存在-20℃。只有少数NEB内切酶若贮存时间超过30天建议保存在-70℃。
•10XNEBuffer也应保存在-20℃。
稳定性
•NEB每4个月都会对所有的内切酶进行活性检测。使用期限标注在每管产品的标签上。
•在任何情况下,都应尽可能的避免将酶置于高于-20℃的温度下。
对照反应
如果在切割底物DNA时遇到了问题,建议加入以下对照实验:
•酶切对照DNA(含有多个已知内切酶切割位点的DNA,如LambdaDNA或腺病毒-2DNA),以检测内切酶的活性。
•如果对照DNA能够被切割而实验中的底物DNA不能,可以将这两种DNA混合在一起再进行酶切,以检测实验用的底物DNA中是否存在抑制反应的物质。如果确实存在某种抑制因子(通常为盐、EDTA或酚),则混合之后对照DNA也不能被切割。
星号活性
•当内切酶在非zui适条件下使用时可能会产生星号活性。
•可以通过以下方法降低星号活性:使用高保真(HF)内切酶、缩短温育时间、使用省时内切酶或者增大反应体积。
联系人
  • 张小姐

    18616507272

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