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谈谈有关NEB内切酶反应的经验和技巧

  • 发布日期:2018-03-27      浏览次数:12953
    • 酶切反应条件的优化当建立NEB内切酶酶切反应体系时有几个关键因素需要考虑。下面整理了以下有关NEB内切酶反应的经验和技巧。
      标准反应体系:
      限制性内切酶10units*
      DNA1μg
      10XNEBuffer5μl(1X)
      总反应体系50μl
      温育温度因酶而异
      温育时间60分钟
      *足够切割所有类型的DNA。
      省时酶切反应体系:
      限制性内切酶1μl
      DNA1μg
      10XNEBuffer5μl(1X)
      总反应体系50μl
      温育温度因酶而异
      温育时间5-10分钟*
      *具有省时酶切特性的内切酶也可以过夜反应而没有星号活性。
      NEB内切酶
      •从冰箱取出后请一直置于冰上。
      •酶zui后加入到反应体系中。
      •加入酶之前将反应混合物混匀,可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁,然后在离心机中快速离心。切忌振荡混匀。
      •一般情况下,我们推荐使用5-10单位酶量/μgDNA,基因组DNA用10-20单位酶量消化1小时。
      •NEB推出一系列的高保真(HFTM)内切酶,为建立酶切反应体系提供了更多便利。
      •如果使用RE-Mix®,请参考2013﹒2014商品目录276页的操作方法。
      DNA
      •避免酚、氯仿、酒精、EDTA、变性剂或过多盐离子的污染。推荐在纯化过程中多清洗几次。
      •甲基化的DNA会抑制某些酶的切割效率。
      缓冲液
      •使用终浓度为1X的缓冲液。
      •BSA已被添加到NEB缓冲液1.1、1.2、1.3和CutSmart缓冲液中,无需额外添加BSA。
      •在不需要BSA即可达到*活性的酶切反应中如果加入BSA也不会影响酶切效果。
      反应体系
      •建议在50μl反应体系中消化1μg底物DNA。
      •加入内切酶的量应不超过总体积的10%,以避免甘油过量引起的星号活性。
      •内切酶贮存液中的添加物(如:甘油和盐)和底物溶液中尚存的残余物(如:盐、EDTA或乙醇)会导致小体积反应出现问题。下述为小体积反应技术指南。
      酶切反应体系的选择
      *当内切酶用量小时,用推荐稀释液稀释后使用。
      **使用10μl反应体系时,温育时间不要超过1小时,以防蒸发。
      温育时间
      •标准体系温育1小时,省时酶切体系温育5-15分钟。
      •使用省时内切酶。
      •许多内切酶都可以用更少单位的酶消化16小时。
      终止反应
      若消化后的DNA不需要进行后续实验操作:
      •用终止液终止反应[50%甘油、50mMEDTA(pH8.0)和0.05%溴酚蓝](如NEB#B7021)。按每50μl反应体系中加入10μl的比例进行。
      若消化后的DNA需要进行后续实验操作:
      •用热失活法(以确定该酶能否热失活)。
      •若该酶不能热失活,利用商业化的离心柱或酚/氯仿抽提去除内切酶。
      贮存
      •大多数内切酶建议保存在-20℃。只有少数NEB内切酶若贮存时间超过30天建议保存在-70℃。
      •10XNEBuffer也应保存在-20℃。
      稳定性
      •NEB每4个月都会对所有的内切酶进行活性检测。使用期限标注在每管产品的标签上。
      •在任何情况下,都应尽可能的避免将酶置于高于-20℃的温度下。
      对照反应
      如果在切割底物DNA时遇到了问题,建议加入以下对照实验:
      •酶切对照DNA(含有多个已知内切酶切割位点的DNA,如LambdaDNA或腺病毒-2DNA),以检测内切酶的活性。
      •如果对照DNA能够被切割而实验中的底物DNA不能,可以将这两种DNA混合在一起再进行酶切,以检测实验用的底物DNA中是否存在抑制反应的物质。如果确实存在某种抑制因子(通常为盐、EDTA或酚),则混合之后对照DNA也不能被切割。
      星号活性
      •当内切酶在非zui适条件下使用时可能会产生星号活性。
      •可以通过以下方法降低星号活性:使用高保真(HF)内切酶、缩短温育时间、使用省时内切酶或者增大反应体积。
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