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详谈RNA提取试剂在rna提取中的作用
点击次数:390 发布时间:2018-01-25
氯仿是分子量比较大的有机溶剂,在提取rna时,氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。rna提取过程,有机相中主要是酚和蛋白结合,从而使得蛋白和rna脱离,rna进入水相。
氯仿的作用有多个方面,加入氯仿,虽然有变性蛋白质的作用,但是其主要用处是用来分相,实际上是加速有机相和水相的分层。一般的RNA提取试剂TrizolReagent在4度下是油状悬浮液,提高温度,放置一段时间,自然也会分相。离心后混合物分成三层:下层苯酚-氯仿层,中间层,上层无色的水样层。rna无一例外地存在于水样层当中。水样层的容量大约为400ul。【标准:1mltrizol加200ul的氯仿,水样层的容量大约为所加trizol 容量的60% 】
上层水相,ph 5.1左右,当溶液ph在酸性的时候,rna分子就会沉淀在酚与溶液的界面,只有rna分子留在水相。而当ph接近中性时,rna就会溶解在水相,(导致ph中性的大概原因是trizol与样品比例不对,应该尽量保证提取量的前提下使trizol过量)trizol法提rna,加氯仿就是要剧烈震荡才行,这样才能彻底地两相混匀。
异丙醇的作用是通过-oh的疏水作用使得rna链中的亲水基团受到保护,等同于沉淀,但是这是个反应时发生在水相中,与前面的氯仿不矛盾。通过将水样层和异丙醇混合来沉淀rna, rna沉淀在离心前通常不可见,形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。
异丙醇是沉淀核酸用的,作用和乙醇一样。只不过用量少一点,0.6v——1v就够了,在水相很多,离心管容积有限,加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀。不过感觉效果不如乙醇,偶尔会有沉淀不出来东西的时候。【400ul的水相对应500ul的的异丙醇。】
醇沉淀是很经常用的方法,因为rna和某些杂质不溶于异丙醇,所以可以用来沉淀。乙醇沉淀的主要目的是沉淀+除盐。
RNA提取试剂TrizolReagent主要物质是异硫氰酸胍,它可以破坏细胞使rna释放出来的同时,保护rna的完整性 。加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。rna存在于水样层中。收集上面的的水样层后,rna 可以通过异丙醇沉淀来还原。
无论是人、动物、植物还是细菌组织,trizol法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>;107)均有较好的分离效果。RNA提取试剂TrizolReagent操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。trizol抽提的总rna能够避免dna和蛋白的污染。故而能够作rna 印迹分析、斑点杂交、poly(a)+ 选择、体外翻译、rna酶保护分析和分子克隆。 提取时需要注意一些问题:提取时要做到超净台内操作、操作带一次性手套、ep管及tip头都要用0.1%处理(0.1%depc浸泡过夜后,高压蒸气灭菌)、小心、细致、晃动及每次移液要轻。这样做的*目的就是两个,一是小心rnase的污染降解rna;二是动作过度暴力破坏rna的完整性。
另外你提的rna做电泳的问题,一般rna电泳应该是做甲醛变性电泳,但是一般的琼脂糖电泳也可以,需要上样量稍微大些,并且跑电泳的时间越短越好。
 
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